產品介紹 | NEB限制性內切酶
2025/05/29
一、限制性核酸內切酶的定義
限制性核酸內切酶（Restriction Endonuclease）是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割DNA鏈的核酸水解酶。這類酶主要來源于原核生物（如細菌），是原核生物抵御外源DNA（如噬菌體）入侵的“分子剪刀”，通過切割外源DNA保護自身基因組。
其核心特點包括：
序列特異性：識別特定的 DNA序列（通常為 4-8個堿基對的回文序列，如EcoRI識別 GAATTC）。
切割方式：在識別序列內或附近切割DNA，產生黏性末端（如EcoRI切割產生5'突出末端）或平末端（如SmaI切割產生平末端）。
二、限制性內切酶的分類
根據酶的結構、輔因子需求及切割特性，可分為以下四類：
1
I類酶
結構：由多個亞基組成，兼具甲基化酶和核酸內切酶活性。
識別序列：長（約 15 bp），包含特異性識別位點和非特異性輔助位點。
切割特點：切割位點遠離識別序列（可達千堿基對），無固定位置，難以用于基因工程。
代表：EcoK、EcoB。
2
II類酶
結構：單一亞基，僅含核酸內切酶活性，甲基化需獨立酶催化。
識別序列：短（4-8 bp），多為回文對稱序列。
切割特點：嚴格在識別序列內或附近固定位置切割，產物末端明確，是基因工程中最常用的類型。
代表：EcoRI（識別 GAATTC，切割產生黏性末端）、HindIII（識別 AAGCTT）、SmaI（識別 CCCGGG，產生平末端）。
3
III類酶
結構：由兩個亞基組成，兼具甲基化和切割功能。
識別序列：約10bp，非對稱序列。
切割特點：切割位點在識別序列下游 24-26 bp 處，位置不固定，應用有限。
代表：EcoPI、HinfIII。
4
IV類酶
功能：特異性識別并切割修飾后的 DNA（如甲基化、糖基化 DNA）。
應用：主要用于研究 DNA 修飾機制，在基因工程中較少使用。
三、限制性內切酶的應用
1
基因工程與分子克隆
DNA 切割與重組：切割目的基因和載體（如質粒），通過黏性末端或平末端連接構建重組 DNA 分子。
載體構建：用于插入外源基因、篩選標記基因等。
2
DNA分析與指紋圖譜
限制性片段長度多態性（RFLP）：通過酶切不同個體的 DNA，分析片段長度差異，用于遺傳病診斷、親子鑒定、法醫物證分析。
基因組圖譜繪制：酶切基因組 DNA，通過電泳分離片段，構建物理圖譜。
3
基因診斷與突變檢測
檢測基因中特定序列的缺失、插入或突變（如鐮刀型貧血癥的β-珠蛋白基因檢測）。
PCR-RFLP：結合PCR擴增，酶切產物分析突變位點。
4
其他應用
基因編輯輔助工具：在CRISPR-Cas9系統中，部分限制酶可用于驗證靶點切割效率。
病毒檢測：酶切病毒基因組，分析病毒亞型或變異。
四、限制性內切酶活性的影響因素
1
溫度
最適溫度：多數酶為 37℃（如EcoRI），少數來自嗜熱菌的酶需更高溫度（如 TaqI 為 65℃）。
低溫影響：低溫下酶活性降低，但通常不會失活（可在冰上操作防止 DNA 降解）。
2
緩沖液成分
金屬離子：需 Mg2?作為輔因子（部分酶需 Mn2?，但可能降低特異性）。
鹽濃度：不同酶對NaCl濃度需求不同，分為高鹽（>100 mM）、中鹽（50-100 mM）、低鹽（<50 mM）緩沖液。
pH 值：多數酶最適pH為7.2-7.6，極端 pH會導致酶變性。
3
DNA 質量與結構
純度：DNA中的雜質（如酚、氯仿、乙醇、蛋白質、RNA）會抑制酶活性，需純化處理。
甲基化狀態：原核生物中的限制酶會被自身甲基化酶修飾的 DNA（如Dam甲基化的GATC序列）所保護，不切割自身基因組，但會切割未甲基化的外源 DNA。
DNA 濃度與構型：超螺旋質粒DNA較線性DNA更難切割，需增加酶量或延長反應時間。
4
酶的用量與反應時間
星號活性（* 活性）：酶用量過高、甘油濃度 > 5%、低離子強度或存在有機溶劑（如乙醇）時，酶可能切割非特異性序列，導致 “星號活性”。
反應時間：常規酶切需 1-2 小時，不完全酶切可通過縮短時間或減少酶量實現（用于基因組物理圖譜構建）。
5
其他因素
甘油濃度：酶儲存液中甘油濃度通常為50%，反應體系中甘油濃度需低于5%（避免星號活性）。
抑制劑：EDTA（螯合Mg2?）、SDS（破壞酶結構）等會抑制酶活性。
NEB與限制性內切酶
1975年，NEB成為第一家銷售限制性內切酶的公司，并開展限制性內切酶相關的研究與開發項目，進行限制性內切酶的發現、克隆、測序和表征，以及質量提升與生產優化等工作。截止到2008年的統計，NEB科學家發現了500多種限制性內切酶，這些科學家不僅包括NEB內部科學家，還包括許多來自海外的合作研究人員。作為分子生物學發展歷史上的重要書寫者，限制性內切酶未來必將與更多激動人心的應用相結合，推動科學歷史的進步與發展。而NEB仍然將是這段歷史及未來的重要參與者及推動者。
# END #
部分圖片、字體、文字來源于網絡 如有侵權請聯系刪除
