純化攻略 | 凝膠過濾層析技術(shù)：從機(jī)制到應(yīng)用的系統(tǒng)化指南
2025/05/12
凝膠過濾層析
凝膠過濾層析，又稱分子排阻層析或分子篩層析，是一種根據(jù)生物分子大小和形狀進(jìn)行分離的層析技術(shù)。廣泛應(yīng)用于生物大分子的純化、分子量測(cè)定、脫鹽及去除小分子雜質(zhì)、病毒疫苗的純化等領(lǐng)域。
凝膠過濾微觀原理示意
Gel Chromatography
技術(shù)原理
利用多孔凝膠介質(zhì)的分子篩作用，根據(jù)分子大小差異進(jìn)行分離。凝膠介質(zhì)內(nèi)部具有不同大小的孔徑，大分子物質(zhì)無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能沿著顆粒間的空隙移動(dòng)，因此較快通過層析柱；小分子物質(zhì)則可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，路徑較長(zhǎng)，因此較慢通過層析柱。
01
優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)
非常適合對(duì)pH變化、金屬離子或輔助因子濃度以及大環(huán)境情況敏感的生物分子。
凝膠介質(zhì)為惰性的球狀疏松多孔顆粒，不帶電荷，吸附力弱，對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持效果好，具有均勻的分離范圍；
可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在存在必需離子或輔助因子、去污劑、尿素、鹽酸呱啶、高或低離子強(qiáng)度、37℃或寒冷的房間進(jìn)行生物分子的分離；
純化的蛋白可以在任何選定的緩沖液中進(jìn)行收集，緩沖液成分不直接影響分辨率；
對(duì)裝柱效果要求較高，一般推薦使用預(yù)裝柱。
02
材質(zhì)分類
按機(jī)械強(qiáng)度分
軟質(zhì)凝膠（葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠）；
半剛性凝膠（苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）；
剛性凝膠（高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、多孔球形硅膠、羥基化聚醚多孔微球）。
按化學(xué)性質(zhì)分
有機(jī)凝膠（均勻凝膠、半均勻凝膠、非均勻凝膠）；
無機(jī)凝膠（非均勻凝膠）。
03
典型層析步驟
純化設(shè)備的選擇
簡(jiǎn)單的緩沖液交換和除鹽步驟可以使用注射器或者外周蠕動(dòng)泵和預(yù)制的HiTrap柱子一起進(jìn)行。如果進(jìn)行高分辨率分離，就需要色譜系統(tǒng)（AKTA、HPLC等）來精確的控制流速。
凝膠過濾操作
1
平衡
Equilibration
使用相應(yīng)的緩沖液沖洗層析柱，使層析柱平衡至所需的實(shí)驗(yàn)條件中。
2
上樣
sample load
將合適體積的樣品通過樣品環(huán)等容器加入層析柱中。
3
洗脫
Elution
使用平衡緩沖液沖洗層析柱，使加入層析柱的樣品逐漸被分開并洗脫到不同的組分中。
04
凝膠過濾選擇指南
主要考慮到兩個(gè)方面：樣品的應(yīng)用目的和填料的分離范圍。根據(jù)樣品應(yīng)用目的的不同，我們可以將凝膠過濾填料分為如下三種：
1.適用于分析純化的產(chǎn)品
用于分析的樣品，量比較少，而且對(duì)于純度有極高的要求。所以，用于分析純化的層析柱一般不會(huì)太高 (15到30 cm)，上樣體積在柱體積的0.3%到0.5%之間。體積小、高度小的層析柱可以在保證高分辨率的同時(shí)，減少運(yùn)行時(shí)間，并節(jié)省樣品和緩沖液的使用量。
2.適用于制備純化的產(chǎn)品
制備樣品與分析樣品相比，量稍大一些，對(duì)于純度的要求較高但不必達(dá)到分析純度。所以，一般會(huì)選用較高的柱子 (60 cm以上)進(jìn)行純化，上樣體積一般在柱體積的0.5%到4%。
3.適用于脫鹽與緩沖液置換的產(chǎn)品
適用于脫鹽與緩沖液置換的產(chǎn)品：脫鹽與緩沖液的置換，本質(zhì)上就是大分子樣品與小分子 (離子)的緩沖液組分之間的分離。這種情況下，對(duì)于分辨率的要求相對(duì)不如前兩種情況高，而且，由于分子量差異較大，上樣體積可以達(dá)到柱體積的30%。
由于不同凝膠過濾填料的孔徑不同，因此，每種填料都有特定的分離范圍。為了保證純度，推薦在組分分子量相差一倍以上時(shí)，才可以試用凝膠過濾的方法進(jìn)行純化。
Cytiva在凝膠過濾產(chǎn)品的開發(fā)上有著悠久的歷史。到如今，已經(jīng)有數(shù)十款填料與預(yù)裝柱產(chǎn)品，用于不同場(chǎng)景的純化工作。
Cytiva的凝膠過濾產(chǎn)品家族
· Sephadex
Sephadex系列填料誕生于1959年，是Cytiva最早的凝膠過濾填料產(chǎn)品系列。按照填料基架交聯(lián)度的不同，產(chǎn)品名稱用Sephadex G加數(shù)字來區(qū)別 (如G-10、G-15等)，數(shù)字越小交聯(lián)度越大，形成的平均孔徑越小，分離范圍也會(huì)越小。目前，Sephadex填料主要用于脫鹽與緩沖液的置換，是非常經(jīng)典的一款凝膠過濾填料。
圖 Sephadex G-25脫鹽效果實(shí)驗(yàn)
· Sepharose
Sepharose是傳統(tǒng)的偶聯(lián)瓊脂糖填料，非特異性吸附性低，回收率高。Sepharose具有非常寬闊的分離范圍，適合分離分子量大小差異大并對(duì)分辨率要求不高的樣本。
Sepharose CL系列填料由Sepharose和2,3-二溴丙醇反應(yīng)而成，增強(qiáng)了Sepharose的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。特別適合含有機(jī)溶劑的分離，能承受較強(qiáng)的在位清洗，并可以高溫消毒，同時(shí)在流速方面也比傳統(tǒng)的Sepharose填料有了明顯的提升。
Sepharose Fast Flow填料為高度交聯(lián)的瓊脂糖填料，大大加強(qiáng)了機(jī)械性能，流速特快，適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。該填料經(jīng)去電荷處理，非特異性吸附特低，回收率也得到了了提高。極高的化學(xué)穩(wěn)定性，可用多種促溶劑、有機(jī)溶劑工作及1-2M NaOH進(jìn)行在位清洗。
· Sephacryl
Sephacryl具有多種不同分離范圍的產(chǎn)品，提供了廣闊的選擇性。它不僅可以分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質(zhì)粒、甚至較大的病毒顆粒。而且，Sephacryl填料價(jià)格相對(duì)較低，經(jīng)濟(jì)高效，非常適合作為對(duì)實(shí)驗(yàn)成本有顧慮的客戶的第一選擇。
· Superose
Superose系列填料由高度交聯(lián)瓊脂糖構(gòu)成，具有最寬廣的分離范圍，能夠一次性分離生物大分子大小差異大的混合物。填料本身剛性好、顆粒細(xì)小并且大小分布集中，所以允許高流速的純化工作，在中、高壓層析系統(tǒng)當(dāng)中均有良好的使用效果。
· Superdex
Superdex系列是目前Cytiva產(chǎn)品中分辨率和選擇性最高的凝膠過濾填料，流速快且反壓低。此外，Superdex的化學(xué)物理穩(wěn)定性很高，可以在高粘性洗脫液 (如8 M尿素)和相對(duì)較高的流速下運(yùn)行。在常用的水性緩沖液和添加劑 (如去污劑、變性劑)中化學(xué)穩(wěn)定，并可以耐受1 M的NaOH清洗。
· Increase平臺(tái)
Increase平臺(tái)是Cytiva新一代的凝膠過濾預(yù)裝柱產(chǎn)品，專門為小規(guī)模的制備純化及分析設(shè)計(jì)。相比原有的高分辨率凝膠過濾產(chǎn)品，Increase平臺(tái)提供：
更高的通量，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間；
更高的分辨率，提高蛋白純度與分析數(shù)據(jù)的精度；
批次間差異更小，獲得更好的可重復(fù)性。
Cytiva凝膠選擇指南
Cytiva SEC Increase預(yù)裝柱提供了豐富的選擇與卓越的性能，為每一次蛋白純化，樣品分離都保證了不凡的表現(xiàn)。
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