生物制藥潔凈密碼：內毒素檢測與控制策略全解析
2025/04/18
什么是細菌內毒素？
細菌內毒素（Endotoxin）是一種由脂多糖（LPS）、蛋白質和磷脂組成的復合物，分子量約1×10?～20×10?Da，來源于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌、布氏桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌等）的細胞壁中。當革蘭氏陰性菌積極生長時少量釋放內毒素，在死亡或分解后大量釋放內毒素，表現出毒性。
內毒素單位為EU，一般以 EU/ml、EU/mg 或 EU/U（活性單位）表示。
熱原是否就是內毒素？
熱原（pyrogen）系指能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。
細菌內毒素是熱原的一種，即細菌性熱原，但熱原不等于細菌內毒素。在藥檢范疇，細菌內毒素是主要的熱原物質，一般認為無內毒素就無熱原，控制內毒素就是控制熱原。
細菌內毒素的毒性反應？
1.發熱反應：細菌內毒素能引起發熱反應，這是由于其刺激免疫細胞釋放內源性致熱原，致熱原作用于下丘腦體溫調節中樞，使體溫升高。
2. 炎癥反應和免疫損傷：內毒素可激活免疫細胞，釋放大量炎癥介質（如細胞因子、趨化因子等），引發局部或全身炎癥反應。適度的炎癥反應有助于清除病原體，但過度或持續的炎癥反應可能導致組織損傷、器官功能障礙，甚至發展為全身炎癥反應綜合征（SIRS）和多器官功能障礙綜合征（MODS）。
3. 內毒素血癥與內毒素休克：當大量細菌內毒素進入血液，可引起內毒素血癥，嚴重時可導致內毒素休克。內毒素休克是一種急性循環衰竭狀態，表現為低血壓、組織灌注不足、多器官功能障礙等，是革蘭陰性菌感染的一種嚴重并發癥，病死率較高。
4. 器官損傷：
肝臟損傷：細菌內毒素可損傷肝細胞，導致肝功能異常，嚴重時可能引起肝衰竭。
腎臟損傷：內毒素可引起腎臟血管收縮，導致腎臟缺血和腎小球濾過率下降，可能導致急性腎損傷。
心臟損傷：內毒素可影響心肌細胞功能，導致心律失常、心肌損傷，甚至心力衰竭。
肺損傷：內毒素可引起急性肺損傷，嚴重時可發展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。
胃腸道癥狀：內毒素可引起腸道菌群失衡，導致腹瀉、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀。
內毒素的檢測方法
《中國藥典》提供了細菌內毒素檢測的詳細指導意見，主要方法包括凝膠法和光度測定法。
熱原檢查：通常以家兔作為試驗介質，檢查在規定時間里觀察家兔的體溫變化，反應了熱原物質引起哺乳類動物的體溫反應過程。
凝膠法（QC常用）：通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理進行限度檢測或半定量檢測內毒素的方法。
光度法：包括濁度法和顯色法，可定量檢測內毒素的含量。
內毒素控制策略
生物制品中內毒素的來源主要有：菌毒種、生產環境、不規范操作、設備及器械、原輔材料等。對于生物制品生產中內毒素污染的控制最主要的措施是生產過程控制，即嚴格按GMP要求進行生產，嚴格無菌操作，防止內毒素產生。
內毒素對熱的耐受性非常強，常用的濕熱滅菌法(121 ℃，1 h)不能破壞內毒素。破壞內毒素生物活性的最有效方法是干熱滅菌法。一般180℃ 3～4 h、200℃ 60 min或250℃ 30～45min，或用強堿強酸才能徹底破壞它。
生物制藥中內毒素去除策略
生物制藥中的每一個環節都有可能污染內毒素使產品不合格，不僅給生產企業造成很大的經濟損失，也會直接影響該企業的信譽和形象。隨著國家藥監部門對生物制品質量的要求不斷提高，對內毒素的要求也越來越高。
細菌內毒素的去除可采用親合層析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析、超濾法、吸附法等。
親和層析
內毒素的類似物多粘菌素B結合瓊脂糖微球制成填料，可特異性的與內毒素結合，去除內毒素，目前這種方法主要用于科研及微量樣品中內毒素的去除，工業生產中，由于成本昂貴且每個內毒素分子之間性質差異較大，這種親和層析的去除效果有限。工業上目前主要還是用離子交換層析法去除內毒素。
凝膠過濾層析
內毒素在0.4M硫酸銨等鹽的環境中，聚集成超大分子，通常大于1000KDa,而目標分子相對很小，可以通過凝膠過濾層析如S-200進行分離。
深層過濾
深層濾器結合不同的機理，如疏水結合、離子吸附以及分子大小篩選去除內毒素，而其效率取決于許多因素，如濾器材質 (如纖維素、活性炭、硅藻土等)、產品流體特性(如粘度、細胞碎片數量、溫度等) 和流體顆粒特性(如硬度、顆粒大小、聚集性、膠體活性等)。由于通常情況下內毒素帶負電荷（等電點在2左右），因此帶有正電荷修飾的濾器對內毒素的去除效率較高，去除能力可達4-5個log。
疏水層析法
由于內毒素的脂肪A部分有很強的疏水性，因此可以通過和目標蛋白的疏水性差異，使用疏水作用層析進行分離，其去除能力可以達到3-4個log。但內毒素分子會通過聚集而減少疏水結構的暴露，從而使得疏水層析對內毒素清除的效率有所降低，所以需配合添加螯合劑或吸潮劑減少內毒素的聚集體產生從而提高去除效率。
陰離子交換層析
內毒素在常規抗體純化工藝使用的工藝條件中帶負電荷，因此能在陰離子層析操作中去除。一般來說，陰離子層析可以清除3-4個log的內毒素。通常可通過調節上樣載量和柱上駐留時間、pH等提高內毒素去除效率。研究顯示，使用比目標蛋白等電點略高的pH能增加蛋白表面的負電荷，有助于減弱內毒素與目標蛋白的非特異性結合，但也會導致流穿模式下目標蛋白和填料的弱結合，因此需在產品質量和收率之間的進行取舍和平衡。
超濾去除法
一般內毒素的相對分子質量在10KDa以上，以聚體形態分子量能超過100 kDa、直徑達到約0.1μm。因此，可以使用 30-100 kDa孔徑大小的膜去除內毒素。這種方法一般只適合目標分子較小的物質去除內毒素。
內毒素的控制理念
生物制品的成分都是比較復雜的，幾乎所有的生物制品都是復雜的混合物，不容易進行鑒定或者表征。在整個生物制品的生產過程中非常容易受到微生物地的污染，而這些產品往往又是不耐熱的，無法通過終端滅菌來實現無菌控制的，所以我們往往需要從最初的生產步驟就開始對微生物進行控制。以抗體藥物的原液生產為例，它的生產工藝主要包括上游生產和下游生產，各大公司在生產操作中都會采取特定的微生物控制策略。
生產車間必須是符合GMP要求的潔凈廠房，嚴格按規定進行清潔消毒，并定期對潔凈間進行沉降菌和塵埃粒數檢測，合格后方可使用。細菌內毒素很容易吸附在容器上，生產中任何直接接觸制品的設備、容器、生產用具、管路、包括檢測取樣吸管、試管等必須保證無熱原。耐熱器具如玻璃、不銹鋼等應進行干熱滅菌。不耐高溫用具，如膠塞、膠管等，可采用0.2 M氫氧化鈉或鹽酸浸泡4 h以上，然后用新鮮注射用水沖洗至中性，再高壓滅菌。保證注射用水新鮮無熱原。化學原材料應盡量選購無熱原的，常用的化劑可干熱滅菌。
操作者必須嚴格按SOP更衣、洗手、消毒。對于任何非封閉系統的操作，均應采取無菌操作方式。
在商業化生產階段需要對每批配制好的培養基進行微生物限度和內毒素的取樣檢測在整個細胞培養的過程中與產品直接接觸的設備耗材都是經過滅菌或直接使用一次性耗材。這個過程其實是處于一個無菌的狀態，也是非常可控的，這個過程其實是不需要進行內毒素檢測的。在細胞收獲階段，由于這個過程不是無菌操作，所以可以對細胞收獲液進行取樣檢測微生物限度和內毒素。這兩個結果可以反映出在整個收獲階段微生物控制狀況是如何的。常規的下游生產工藝包括洗脫、層析步驟、病毒滅活、過濾、超濾、分裝等。像先脫、層析后可以對細菌內毒素和微生物負荷進行檢測。
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